化妆品中霉菌和酵母菌的检验 - 达人(moil)

2006/03/05 | 化妆品中霉菌和酵母菌的检验
类别(科学) | 评论(2) | 阅读(779) | 发表于 23:47: 化妆品中霉菌和酵母菌的检验
1 概述

1.1 化妆品真菌污染的现状
真菌在自然界中分布甚广,化妆品的酸碱度,温度湿度和营养适合其生长繁殖。目前国内外有资料表明，化妆品中真菌污染是相当严重的。Wilson对眉目化妆品进行微生物检查，结果真菌污染率为12%，从睫毛油里检出茄病镰刀菌，密封的眼用化妆品染菌率为1.5%,在使用过程中急剧增至60%。所染真菌中曲霉，念珠菌居首。我国部分省市化妆品中霉菌染菌率也不低，一般为7～62.7%。有资料报道在100份化妆品中分离到真菌15个（属14种）。优势菌为酵母属，其次为青霉属和曲子霉属等。Kuehne等人对233名妇女眉笔眼影霉菌检查，结果有115人（份）检出不同真菌19属（种），计有草酸青霉、黄曲霉、交链孢霉和致病的白色念珠菌和新型隐球菌等。

1.2 化妆品的真菌病
1.2.1 念珠菌病：由白色念珠菌（白色假丝酵母）引起的急性、亚急性或慢性真菌病，可侵犯皮肤、粘膜或指甲，也可侵犯内脏或血行播散引起鹅口疮、唇炎、甲沟炎、泛发性皮肤念珠病、念珠性肉芽肿、支气管及肺念珠病、心内膜炎及脑炎和血行播散性念珠菌病等。

1.2.2 青霉病：由少数青霉菌引起呼吸道及肺部感染，使皮肤暴露部位出现湿疹样改变，还可致敏引起鼻炎及哮喘。

1.2.3 新型隐球菌病:由新型隐球酵母及其变种引起的一种深部真菌病,可侵犯肺、骨骼、皮肤淋巴结及内胖器官，主要侵犯中枢神经系统，引起隐球菌性脑膜炎。

1.2.4 曲霉病:由曲霉菌引起,可侵犯皮肤,指甲、外耳道、鼻窦、眼、气管、肺、心膜、子官、脑膜等器官形成炎性肉芽肿。

1.2.5 眼真菌病:真菌性角膜炎可由曲霉菌、镰刀菌、白色念珠菌等真菌引起角膜溃疡，见表3-2-1。

作者
年份
倒数
菌种及株数

Fazakas
1955
20
烟曲霉5，黄曲霉2，放线菌4，毛霉2，其他7

Gingerich
1963
125
曲霉16，白色念珠菌17，镰刀菌12，其他80

Palack
1971
33
镰刀菌15，头孢霉11，念珠菌2，弯孢霉21，曲霉2，其他2

渡道郁绪
1977
59
曲霉21，头孢霉16，白色念珠菌14，其他8

齐绪哲、谭玉章
1957～1965
13
白色念珠菌7，曲霉3，镰刀菌1，酵母菌1，头孢霉1

范德章
1978
204
曲霉123，镰刀菌43，其他39

1.2.6 真菌毒素中毒：引起皮肤光过敏性皮炎、湿疹及皮肤变态，严重者导致机体中毒。

1.3 化妆品霉菌检验的意义
1.3.1 霉菌广泛存在于自然界中，化妆品从原料到成品生产过程各环节都可能存在霉菌污染源。

1.3.2 化妆品是霉菌生长繁殖的良好培养基。霉菌适宜在中性和微酸性的条件下生长，而一般化妆品的pH在4～7之间。霉菌、酵母菌生长最适温度为20～30℃，而化妆品储藏条件是在此温度范围内。化妆品中皆具备霉菌生长需要的营养，有的还含有人参、蜂蜜、蛇油等营养丰富的物品。

1.3.3 霉菌可产生毒素，故化妆品除进行霉菌计数及分类鉴定外，必要时还应开展霉菌毒素测定。

1.4 几个概念

1.4.1 真菌及其在生物学上的地位

真菌是具有细胞壁、无根茎叶、不含叶绿素，以吸收方式吸取营养，具真核细胞的一类微生物。根据目前国际上广泛应用的Ainsworth分类系统及陈世骧等（1979）提出三个总界，下设五个界的分类系统，真菌在生物学上的地位如下：

1.4.2 霉菌

霉菌是指真菌中不形成子实体的丝状菌类。霉菌不是分类学上的名词，是一种俗称。霉菌常寄生于粮食、食品、化妆品等物品上，使其发霉变质。有的霉菌产毒，危害人体健康；有的霉菌应用于工业，造福人类。

1.4.3 霉菌的形态

一般霉菌鉴定主要靠形态分类。不同培养条件下生长的同一种霉菌形态也有差异，因此各种霉菌均有其标准培养基，如青霉和曲霉用察氏培养基、镰刀菌用马铃薯培养基、酵母菌用麦芽汁等。

霉菌的形态主要分菌丝和孢子。

在显微镜下观察霉菌的菌丝呈管状，直径2～10μm。有的霉菌（如根霉和毛霉）菌丝无隔膜，为多核细胞。大多数霉菌如青霉和曲霉菌丝有隔膜。有些霉菌的菌丝密集成团、坚硕称菌核。有些霉菌的菌丝特化成厚的壁呈球形的壳细胞。菌丝又有一定程度的分化。长在培养基内的称营养菌丝；在培养基上生出的称气生菌丝；产生孢子的气生菌丝又称繁殖菌丝，菌丝能产生不同色素，呈不同颜色。这些都是分类鉴定的依据。

霉菌的孢子是繁殖器管，孢子分为无性生殖孢子和有性生殖孢子。无性生殖孢子有叶状孢子、芽生孢子（酵母菌、念珠菌）；厚膜孢子（镰刀菌）；节孢子（白地霉）。分生孢子和孢子囊孢子均为无性生殖孢子器官。这些不同形态和不同着生状态的生殖器官是霉菌分类鉴定的重要依据。

霉菌的有性生殖是经两个细胞交配后产生的有性了解子。如卵孢子（水霉）、接合孢子（毛霉和根霉）、子囊孢子（醇母）。

2 霉菌及酵母菌总数的测定方法
2.1 霉菌数测定

霉菌数的测定是指化妆品检样在一定条件下培养后，lg或lml化妆品中所污染的活霉菌数量。藉此测定，判明化妆品被霉菌污染的程度及其一般卫生状况。

2.1.1 培养基和试剂

2.1.1.1 稀释液

成分：氯化钠 8.5g

吐温-80 7g

蒸馏水 1000ml

卵磷脂 1g

制法：先将卵磷脂用少量蒸馏水溶解，然后与氯化钠，吐温80加到蒸馏水中，混匀、溶解、分装、高压灭菌121℃20min。

2.1.1.2 虎红（孟加拉红）培养基（1）

成分：蛋白胨 5g

葡萄糖 10g

磷酸二氢钾 1g

硫酸镁（含7H20） 0.5g

琼脂 20g

1／30000虎红水溶液 100ml

蒸馏水 1000ml

制法：将上述各成分（除虎红外）加入蒸馏水中溶解后，再加入虎红溶液，分装后，高压灭菌121℃20min。

2.1.2 操作步骤（2）

似无菌操作称取检样10g（或10m1）加到90ml稀释液中，充分振荡，使之溶解并混匀，即为1:10稀释液。

用灭菌吸管吸取1m1 1:10稀释液，沿管壁注入装有9ml灭菌稀释液的试管中，另取1支lml灭菌吸管反复吸吹，使之混匀，即为1:10稀释液，同法再作1:1000稀释液。

取1:10，1:100，1:1000的稀释液各1ml分别注入灭菌平皿内，每个稀释度各用2～3个平板，置25～28℃培养72小时。每天都应观察，见有菌生长就要及时计数，以免蔓延生长而无法计数。

2.1.3 计算方法

先数每个平板上生长的霉菌菌落数(3)（如长有细菌不作计数），求出每个稀释度的平均菌落数。判定结果时，选取平均在30～100个范围之内的菌落数乘以稀释倍数，即为每克（或每毫升）检样中所含的霉菌数。若有两个稀释度的菌落数皆在规定范围之间或三个稀释度皆不在此范围时，应参照细菌总数的报告方式报告。

2.1.4 结果报告

以每克（或每毫升）化妆品含霉菌菌落数个七（ml）表示之。

注解：
（1）用于测定霉菌总数的常用培养基有三种，它们的优缺点如下：用改良察氏培养基测定霉菌数时生长速度明显较慢；用沙氏培养基测霉菌总数时所得回收菌数较少；用虎红琼脂测霉菌总数较理想，首先培养基配制简单，测得回收菌数准确，菌落出现较早，虎红可使霉菌染上颜色，易观察。

（2）三种不同分离方法测霉菌数的比较：用离心集菌法操作，步骤繁琐、时间长、环节多、易污染、影响结果准确性因素较多；用培养基稀释法测定时操作繁杂，结果与常规法无显著差异，因此最好还是用常规法测定霉菌数，既操作简单又省时，结果准确。

（3）菌落形态的观察

霉菌在虎红平板上的菌落形态具有放射状或树枝状的菌丝是菌落特征。初形成时多无色透明，有明显的折光性，在较暗背景下，以透射光观察易于识别。少数生长在琼脂表面的菌落，起初时似如一小块水迹，需借助暗反射光才能看清。形成孢子的菌落多数有各种颜色，是鉴定的特征之一。

2.2 酵母菌数测定在化妆品中的应用范围

凡化妆品内含有蜂蜜和皇浆等的奶状、蜜状制品均可在用虎红琼脂测霉菌数的同时用酵母膏。蛋白胨。葡萄、糖琼脂培养基（简称YPD）测酵母菌数。因为霉菌和酵母菌种类繁多，采用以上两种培养基将适合更多的霉菌酵母菌生长。

2.2.1 培养基的配制

酵母膏。蛋白胨。葡萄糖琼脂培养基（YPD）

成分：蛋白胨 10g

葡萄糖 20g

琼脂 15～20g

蒸馏水 1000ml

制法：以上各物于蒸馏水中加热溶液，分装，经115℃、15min高压灭菌。

2.2.2 酵母菌菌落形态

在虎红琼脂板上，多数为圆形凸起，边缘整齐，表面光滑湿润，呈不透明乳脂状，乳白色或粉红色，少数表面粗糙或皱褶。有的菌落周边呈细分枝状，位于琼脂内的菌落可呈铁饼形、三角形及多角形。菌落外观与细菌菌落不易区别时，应挑取菌落用水制片形，置于高倍显微镜下观察，其细胞个体比细菌大得多。一般细菌为1μm；酵母为2.6～7μm。此外酵母具特征性的形态，即有的酵母细胞一端带有芽生抱子。在YPD琼脂平板上的酵母菌落与虎红平板上的形态相似，但稍大，多数为乳白色。

3 霉菌的鉴定技术
3.1 培养基

霉菌在不同培养基上形态可不同，因此确定菌种要用标准培养基，如察氏培养基，YPD,葡萄糖蛋白胨玉脂等。为了促使各真菌不同特点明显显示，又可用特殊培养基米粉吐温琼脂）促使白念珠菌产生厚壁孢子；马铃薯葡萄糖琼脂刺激真菌色素产生，加入一定量微量元素促使某些真菌产毒或抑制毒素产生。

3.2 菌种分离

用接种钩挑选单个菌落接种于灭菌察氏斜面上，以获得纯菌种。

3.3 菌落的观察

将菌种点种于培养基平板上，每平皿以"品"字形排列点种3点培养。可测定其菌落直径（即生长速度）及观察菌落形态特点。

3.4 微培养法（载玻片法）

取直径7cm圆形滤纸，铺于直径9cm平皿内，上放U玻棒，在棒上放洁净坡片，盖好平皿后灭菌；在滤纸上加约10ml灭菌20%甘油溶液；在载玻片中央滴融化琼脂，使成薄片状，盖上灭菌大盖玻片；在边上接种孢子悬液；25～27℃培养，随时可取出在低倍镜下观察真菌生长发育情况及结构特征。此法缺点是观察时孢子易外溢而污染环境。

3.5 菌丝尖端培养

将单介菌落点种在培养皿中央,当菌落生长直径约1cm时,切取小块菌落边缘琼脂,将其种植在新鲜斜面上,进行培养。

3.6 单孢子分离

遇菌种子不纯时最好采用显微镜单孢子分离器进行分离。若无仪器可用下法分离。

3.6.1 透明薄平板的制备：在100ml蒸馏水中加1.8～2g精制细琼脂,使融化并用棉花过滤,分装试管。每管5～6ml，在121℃下经30min灭菌后倾皿,即为透明薄平板。

3.6.2 孢子悬液的制备:将孢子稀释至适当浓度(约102孢子/ml),取1～2滴滴于上述平板上使分布均匀,平放3～5min,以28℃培养4～6小时进行检查。

3.6.3 单孢子分离:将上述平板反扣在显微镜载物台上,用低倍镜检查,可观察已萌芽的单孢子,选取与其他孢子距离较远的单个孢子,做上记号,用无菌眼科小刀按记号切下琼脂,移植于新鲜培养基斜面上。

3.7 悬滴培养

观察真菌发芽率及生长情况

3.7.1 孢子悬液制备:取一白金耳菌液于25ml灭菌生理盐水的玻珠三角烧瓶中,充分振摇15分钟,使孢子单个分散。

3.7.2 制作标本:加一滴灭菌水于凹玻片之凹窝内,将培养基融化冷却至45～50℃并加入2滴孢子悬液摇匀,在盖玻片上涂布薄层,反盖于凹玻片的窝上,用凡士林封固,经25～30℃培养。

3.7.3 镜检:培养10～15小时后取出标本在高倍镜下观察真菌的发芽率。

3.7.4 发芽的计算

发芽率=α/A×100%

式中: α----发芽孢子数；

A----发芽及不发芽孢子总数。

3.8 制片观察

为了详细观察真菌形态结构以准确鉴定,必须进行显微镜检查,故制片技术是重要的。

3.8.1 制片液剂:霉菌最常用的、效果好的制片液剂是乳酸苯酚液。它既有杀菌又能保持数月不干。其成分如下：

苯酚（结晶C.P） 10g

乳酸(相对密度1.21) 10ml

甘油 20ml

蒸馏水 10ml

配制法是将苯酚加在水中加热溶解，加入乳酸及甘油混匀即成，折射率为1.45。

3.8.2 标本制备：放1滴乳酸苯酚液于载片中央，用无菌针挑取极少量典型材料于液滴中，用二根分离针小心撕开成小块，切忌搅揉，盖上盖玻片，加滴量适当则可避免气泡。

赶去空气气泡方法（特别适用于青霉属）：将材料放在载片的一滴酒精内，等大部分酒精挥发后，加入一大滴乳酸苯酚，撕开标本，盖上盖玻片即成。

当乳酸苯酚折射率与真菌菌丝接近时，无色构造极模糊，那就需要染色。但酵母等只需用水作介质就可制片了。

3.8.3 制片的保存：用黑色的虫蜡，透明无色的指甲蜡为封片剂。

注意事项：盖玻片盖时要没有外渗，没有空气。如有空气要用制片剂充填，封片剂稠度要适当，以能缓慢滴流为度。虫蜡用酒精调至适当浓度。指甲蜡可加少量丙酮稀释。用转盘及细刷子先封上极薄的一层，待封片剂全干燥后再加封。

4 化妆品中几种霉菌的鉴定
在化妆品中普遍存在着霉菌，检出率相当高，这里仅列出几种代表性霉菌。

4.1 白色假丝酵母（Candida albicans berkhout）

酵母样菌落白色、乳白色，有假菌丝也有真菌丝，在玉米琼脂上产生厚壁孢子，为无性生殖，细胞圆形、卵圆形、长椭圆形（2×6μm），芽生。

4.2 新隐球酵母（Cryp tococcus neoformans）

乳白色细菌样粘液性菌落。不规则圆形，表面有蜡样光泽。无菌丝。无性生殖结构为多样发芽形式，菌体孢子形态多样。

4.3 根霉（Rhizorus）

菌落为白色灰褐到黑褐色，疏松菌丝。背面灰色蔓延，生长迅速而不分隔的匍匐菌丝，生假根。与假根相对面上生出产孢结构，簇生或单生，长1000μm，褐黑球形孢子囊，有囊托、轴顶生于囊梗。分生孢子形态不规则，无色或浅褐色单孢子。子囊了解子在孢囊内。

4.4 毛霉（Mucor）

菌落白色到灰褐色，絮状蔓延生长迅速，菌丝粗不分隔。产孢子结构为单生或轮生，孢子囊顶生，单生于囊梗，褐色球形，有囊轴无托。分生孢子球形椭圆形，单孢无色光滑。子囊孢子在孢囊内。

4.5 交链饱霉（Alternara）

菌落绒状灰黑至黑色，蔓延生长，分生孢子梗有隔，分枝或不分枝褐绿色较短。

分生孢子倒棒状，暗褐色一顶端呈喙状分隔，子囊孢子呈链状，有时链分枝于梗上。

4.6 芽枝霉（Cladosporium）

菌落绒状、絮状橄榄色，黑绿色，背面黑绿、局限生长。分生孢子梗直立分隔，有短枝暗绿色。分生孢子呈卵形、卵圆形、有隔的长形。子囊孢子成链并分枝，顶生于梗呈树枝状。

4.7 黄曲霉（Aspergillus flavus）

菌落生长较快，丝绒状黄绿色，表面粉末状。分生孢子头放射状， 200～500μm分生孢子梗生在基质壁上粗糙无色，顶囊烧瓶形、球形。分生孢子球形、近球形，少数椭圆形，粗糙有菌核。

4.8 杂色曲霉（Aspergill versicoir）

菌落局限像小钮扣，丝绒状、絮状，黄色、橙色、黄绿、豆绿色，有或无渗出液，背面无色或黄褐色、紫色。分生孢子头球形或放射状，分生孢子梗壁光滑无色，呈放射状排列。顶囊烘瓶形，稍呈椭圆形。分生孢子球形、近球形，粗糙，有的有球形的壳细胞。

4.9 草酸青霉（Penicillium Oxalicam）

菌落绒状，暗蓝绿色，反面无色略带黄色。镜检为非对称性帚状枝，大多二轮，较紧密，偶有单孢或具尾副枝，分生孢子椭圆形，光滑。

中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所信息室; 0

http://moil.5d.cn/

评论Comments